Congelamento del seme canino: una tecnologia di riproduzione assistita
La crioconservazione del materiale seminale del cane rientra in quelle che sono definite in medicina veterinaria come le tecnologie di riproduzione assistita (ART). Queste tecniche hanno permesso negli ultimi decenni di compiere notevoli passi avanti nella gestione e nel miglioramento genetico degli animali da compagnia.
Già nel 1776 l’abate Lazzaro Spallanzani osservò che, portando gli spermatozoi alla temperatura della neve, nel momento in cui questi venivano riportati alla temperatura corporea, era possibile far riacquisire loro la motilità originaria. La capacità di una cellula di sopravvivere al congelamento dipende dalla sua forma e dalle sue dimensioni, dalla quantità di acqua in essa contenuta e dalle proprietà di permeabilità della membrana cellulare. Il congelamento è un evento stressante per tutti i tipi di cellule ma gli spermatozoi, grazie al loro piccolo volume e alla compatta organizzazione cellulare della testa, subiscono pochissime variazioni di struttura durante tale processo. Nonostante questo, al momento dello scongelamento, essi presentano diverse alterazioni e una riduzione complessiva della motilità.
Negli ultimi anni la richiesta d’interventi di fecondazione artificiale nella specie canina è notevolmente aumentata, favorendo gli scambi di materiale seminale tra allevatori di cani di tutto il mondo e aumentando, di conseguenza, la necessità di disponibilità dello stesso. In quest’ottica si spiega come il solo materiale seminale refrigerato non basti a coprire tale richiesta e come il congelamento del seme sia una tecnica ormai d’importante utilizzo. La possibilità di poter trasportare il materiale seminale a notevole distanza permette ai proprietari di trarre innumerevoli vantaggi da un punto di vista logistico, potendosi avvalere del seme di stalloni stranieri e potendo spedire essi stessi il seme del proprio cane in paesi lontani senza movimentazione di animali. In questo modo diminuiscono i rischi sanitari che da tali spostamenti possono derivare e soprattutto si annulla lo stress del viaggio a carico della femmina che può portare ad un blocco del calore .
L’utilizzo del seme congelato permette, quindi, lo scambio di materiale di alto valore genetico tra luoghi lontani così come la sua conservazione per periodi indefiniti.
Questa biotecnologia riproduttiva consente la conservazione delle razze in estinzione e offre la possibilità di poter utilizzare un maschio per più femmine aumentano le condizioni igienico-sanitarie.
Il prelievo del materiale seminale e la sua valutazione rientrano nell’esame semeiologico del maschio riproduttore e sono il requisito perché il seme di uno stallone possa essere utilizzato a questo scopo.
Il prelievo manuale del seme nel cane è la tecnica più comunemente utilizzata, la cui esecuzione è resa qualitativamente migliore e, in certi casi, unicamente possibile, dalla presenza di una femmina in estro. Laddove questo non sia possibile si possono utilizzare dei tamponi vaginali, congelati, impregnati di secrezioni vaginali di cagne in estro, da scongelare a seconda delle necessità, oppure, ferormoni sintetici come il metil-r-idrossibenzoato applicato sulla vulva delle cagne utilizzate per la stimolazione del maschio: non sempre, però, questo metodo è risultato essere efficace.
Un altro metodo di prelievo vede l’utilizzo della vagina artificiale in lattice, collegata ad una provetta graduata, sterile. Sarebbe da preferire l’utilizzo di contenitori di vetro a questo fine, vista l’influenza negativa sulla motilità degli spermatozoi che il lattice ha dimostrato avere.
Il principio della vagina artificiale è quello di ricreare le condizioni naturali delle vie genitali femminili al momento del coito e nel raccogliere tutto l’eiaculato senza rischio di perderne una parte o di contaminarlo ulteriormente.
Il prelievo del seme andrebbe sempre effettuato in un ambiente il più possibile confortevole, tranquillo e fornito di una pavimentazione anti scivolo.
Un’importante accorgimento è utilizzare, per le varie operazioni sul seme, siringhe da inseminazione artificiale prive di stantuffo in lattice, vista la tossicità di questa sostanza per i gameti.
Il materiale seminale è eiaculato in tre frazioni:
- PRIMA FRAZIONE, prostatica. Generalmente il volume non supera i 5 ml, di colore trasparente ed acellulare.
- SECONDA FRAZIONE, frazione nobile: spermatica. Origina dalla coda dell’epididimo: il magazzino degli spermatozoi. Il volume varia da 1 a 4 ml ed il colore è opalescente per la presenza dei gameti.
- TERZA FRAZIONE, prostatica, il cui volume è notevole ed estremamente variabile da 2,5 a 80 ml, nuovamente di colore trasparente .
Una volta effettuato il prelievo del materiale seminale questo viene valutato per capire se risponde a tutti i requisiti necessari perché la crioconservazione possa essere effettuata.
Le ricerche in merito allo sviluppo delle tecniche di congelamento del seme di cane hanno dimostrato la scoperta dei benefici effetti, sulla conservazione degli spermatozoi, delle sostanze crioprotettrici.
La membrana plasmatica rappresenta il fulcro del problema nella crioconservazione del materiale seminale. Essa funge, infatti, da barriera fisica che protegge gli spermatozoi dai cambiamenti esterni. Perciò è abbastanza facile comprendere come ogni evento destabilizzante o di stress a carico di questa struttura, durante la fase di congelamento o di scongelamento, esiti in un deficit, anche grave, della fertilità.
Se la membrana plasmatica viene alterata, durante il congelamento, si avrà la formazione all’interno delle cellule di cristalli di ghiaccio che deformandola provocheranno la rottura di questa importante struttura.
I crioprotettori sono sostanze che proteggono gli spermatozoi dai danni che avvengono a temperature tra 0 e -50°C.
La sostanza maggiormente utilizzata come crioprotettrice è il glicerolo. Sembrerebbe però, che questo elemento potrebbe indurre dei cambiamenti a carico dei lipidi di membrana modificando così il grado di permeabilità degli spermatozoi all’acqua.
Un’altra sostanza crioprotettrice ampiamente usata per la conservazione del materiale seminale è il tuorlo d’uovo. Sul suo utilizzo i pareri sono discordanti, non tanto per i risultati ottenuti con il suo impiego, quanto per il potenziale patogeno di questo elemento.
Per questo motivo la sua sostituzione nei mestrui diluitori, con sostanze aventi le medesime funzioni, rappresenta uno degli obbiettivi da raggiungere.
Un altro importante aspetto che influisce in maniera negativa sulla qualità del seme crioconservato è l’eccessiva formazione di ROS (specie reattive dell’ossigeno), causata dallo stress ossidativo al quale il materiale seminale è sottoposto durante tale metodica di conservazione.
Da qui nasce la necessità per i ricercatori di introdurre nei mestrui diluitori sostanze antiossidanti. La particolare suscettibilità degli spermatozoi al danno da stress ossidativo risiede nell’alto contenuto in acidi grassi polinsaturi (PUFAs) delle loro membrane plasmatiche la cui ossidazione è alla base dei processi sopra descritti.
Nella specie canina la differenza individuale nella risposta alla crioconservazione è estremamente varia. Per questo motivo in realtà, in commercio, esistono differenti mestrui diluitori per la crioconservazione del materiale seminale di cane, ai quali vengono aggiunte varie sostanze.
Metodo di congelamento
È necessario isolare la frazione nobile dell’eiaculato (quella composta dagli spermatozoi). Questo passaggio si può effettuare durante la raccolta, differenziando le tre frazioni oppure in seguito a centrifugazione a 300-500 g per 10 minuti. A questo punto si può procedere con il congelamento vero e proprio addizionando il seme con gli extender utilizzati.
Il congelamento del seme si può effettuare con due metodiche che prevedono l’utilizzo di freezer biologici:
- Sistemi di congelamento computerizzati che permettono il raggiungimento lento, graduale e preimpostato, tramite una curva di discesa della temperatura.
- Utilizzo dei vapori d’azoto.
Legislazione
Per quanto riguarda le normative che regolamentano l’utilizzo delle tecniche di conservazione del materiale seminale, nel nostro paese è possibile effettuare inseminazione artificiale sia con seme refrigerato che congelato, utilizzando la normale modulistica, relativa agli accoppiamenti naturali; per la movimentazione di materiale seminale congelato una particolare modulistica deve accompagnare il seme. La spedizione di seme congelato dovrà essere accompagnata da un “nulla osta” rilasciato dal Servizio Veterinario del Ministero della Salute e da una serie di esami sierologici (test per Brucella, Leptospira e Rabbia) da effettuarsi sul cane donatore al momento dell’esame semeiologico. L’elenco di tali documenti dovrà essere richiesto di volta in volta al Ministero della Salute in quanto possono essere diversi a seconda del paese da cui si vuole importare o esportare il materiale seminale e/o a seconda del periodo contingente.
La spedizione del seme avviene tramite “Dry Shipper”, un particolare bidone da viaggio con azoto liquido. A differenza del seme refrigerato, il materiale seminale congelato potrà essere spedito o importato in qualsiasi momento, in quanto, l’unico requisito necessario e il suo stoccaggio in azoto liquido. Unitamente al seme congelato dovrà essere fornito un certificato che attesti la qualità del seme al momento del suo prelievo, la concentrazione di spermatozoi all’interno di ciascuna paillette, quante paillettes devono essere utilizzate per ogni singola inseminazione e soprattutto la qualità del seme una volta scongelato. L’autonomia di un Dry shipper può variare da alcuni giorni a due settimane. Nel momento in cui il seme raggiunge la sua destinazione, sarà cura del veterinario ricevente trasferirlo al più presto in un bidone con azoto liquido per lo stoccaggio.
